再生科学助孕:卵母细胞发育的代谢控制与母体营养,影响备孕结果

在备孕的过程中,很多备孕女性会服用辅酶Q10和左旋肉碱来改善卵母细胞质量,但是却不重视胰岛素抵抗、线粒体功能障碍。而且很多时候不知道为什么要吃,只知道医生是这么嘱咐的。

那么,同样作为医生的我可以很严肃地告诉大家,有些时候医生或许知道营养对卵母细胞很重要,但他可能并不知道,很多时候,我们的营养代谢出现了问题,尤其是线粒体代谢存在障碍,尤其是当体内有不良微生物、重金属的超标时会导致营养代谢效率低下。这就会阻碍我们的能量代谢,导致细胞不成熟。

今天分享这篇文献,重点是要阐述到底什么是卵母细胞的营养代谢及能量代谢,希望告诉大家改善卵母细胞质量不能只吃辅酶Q10和左旋肉碱。

温馨提示:本文涉及研究资料较多,篇幅较长,可直接拉到最后看总结。

摘要

肥胖、糖尿病和相关代谢紊乱是世界范围内的主要健康问题。随着代谢紊乱的流行,相关的医学共病,包括对生殖的有害影响,也在增加。新的证据表明,母亲营养对生殖结果的影响可能是通过卵母细胞代谢介导的,至少部分是这样。能量代谢的平衡和定时是卵母细胞最佳发育的关键。到目前为止,我们对卵母细胞代谢的理解大多来自于外源性营养物质对卵母细胞成熟的影响。

相比之下,代谢酶、细胞内介质和转运系统对卵母细胞发育的内在调节作用较少。具体来说,卵母细胞中酸性转运蛋白水平的降低、葡萄糖/脂质含量的增加和活性氧的增加与减数分裂缺陷、细胞器功能障碍和表观遗传改变有关。因此,卵母细胞的代谢紊乱可能导致代谢紊乱妇女的生殖能力下降。需要深入研究,进一步探索其内在机制。

本文还讨论了几种代谢分析方法。卵母细胞的代谢组学分析周围的颗粒细胞和卵泡液将揭示调节卵母细胞发育的代谢网络,可能导致鉴定卵母细胞质量标记物和预防生殖疾病和后代的不良结局。

卵母细胞的发育

哺乳动物卵母细胞的发育是一个由大量卵巢内外因素调控的复杂过程。卵母细胞起源于原始生殖细胞。PGC迁移到生殖嵴,在那里通过有丝分裂增殖,并从卵原细胞转化为初级卵母细胞[1–C3]。在出生前后,卵母细胞在第一次减数分裂前期的二倍体阶段即生发泡(GV)阶段被阻滞在卵泡内。青春期后,卵母细胞受到刺激,在内源性LH激增后重新开始减数分裂,如GVBD(GVBD)所示。随着微管组织成双极纺锤体,所有染色体在纺锤体赤道处排列,卵母细胞进入中期I期(MI),然后挤压出第一个极体。卵母细胞成熟在中期II期(MII)停止时完成,等待受精[4,5]。卵母细胞的生长和成熟对营养、化学和内分泌环境的变化特别敏感[6]。

卵母细胞的完全发育能力需要同步的核成熟和细胞质成熟[7,8]。表明在这一过程中需要能量产生和活性合成,卵胞质中的细胞器,如线粒体、内质网和高尔基复合体变得更加丰富,并随着卵母细胞的生长而经历动态变化[9,10]。多种代谢产物和代谢相关酶在卵母细胞成熟过程中的多种细胞事件中发挥着重要作用[11–14]。生长中的哺乳动物卵泡由单个卵母细胞、一层或多层周围的体细胞(颗粒细胞)和卵泡膜细胞外缘组成。卵母细胞通过缝隙连接与颗粒细胞结合。这些高度专业化的膜连接介导小代谢物、无机离子和第二信使从一个细胞转移到另一个细胞[15]。卵泡中卵母细胞和颗粒细胞之间的代谢合作一直受到重视[16–18]。颗粒细胞为卵母细胞的培养提供各种能量基质,而卵母细胞通过分泌旁分泌因子控制颗粒细胞的代谢活动[19,20]。

肥胖、糖尿病和相关代谢紊乱是世界范围内的主要健康问题。随着代谢紊乱的流行,相关的医学共病,包括那些影响生殖的疾病,也增加了[21]。特别是,肥胖或糖尿病控制不良的妇女,其不孕、流产、产科并发症、新生儿发病率和死亡率以及后代出生缺陷的风险增加。新的动物研究和临床数据表明,卵母细胞的代谢活性可能是介导这些生殖缺陷的关键靶点。

本文综述了近年来有关卵母细胞生长和成熟代谢事件的研究进展,以及母体营养、卵母细胞代谢和生殖结局之间的关系。此外,还简要介绍了卵母细胞的代谢分析。这些领域的进展可能有助于理解卵母细胞发育的机制,因此,可能会指导进一步确定卵母细胞质量的预测因子,以及治疗不孕症和产科及新生儿预后差的方法。

文献搜索方法:本文从人和动物两个方面对其进行了综述。截至2014年8月,在PubMed上以英文发表的相关研究文章以不同的组合使用了以下搜索词:“卵母细胞”、“卵母细胞质量”、“代谢”、“代谢紊乱”、“母亲营养”、“肥胖”、“糖尿病”、“多囊卵巢综合征”、“代谢组学”,“卵泡液”、“卵丘细胞”、“胚胎”、“生殖结局”、“妊娠”和“表观遗传学”。对摘要进行评估,以确定适合该综述的研究。

卵母细胞的能量代谢

卵母细胞不能完全从卵泡(尤其是颗粒细胞)中分离出来,颗粒细胞为卵母细胞的生存、营养和调节创造了必要的生态位[24]。卵母细胞缺乏进行一些关键代谢过程的能力,因此依赖颗粒细胞的合作为其发育提供代谢物[19,25]。尽管卵母细胞起主导作用,但沟通是双向的,卵泡细胞是相互依赖的。

正如Henry Leese所指出的[27],卵母细胞发育的代谢控制可以考虑在两个水平上:(1)通过酶的数量/活性、细胞内介质和质膜运输系统进行的内在控制[28–C30]和(2)通过提供来自卵泡生态位、雌性生殖道或体外的营养物质进行的外在控制文化环境[31–34]。绝大多数的研究和实践都集中在调控卵母细胞成熟的外源营养素上。相比之下,控制卵母细胞发育的内在途径的潜在作用却很少受到关注。在哺乳动物卵母细胞中检测到一些与代谢有关的内源性酶,总结见表1。图1概述了卵母细胞发育的代谢控制,特别是减数分裂、表观遗传学和细胞器。

再生科学助孕:卵母细胞发育的代谢控制与母体营养,影响备孕结果

图1。卵母细胞发育过程中减数分裂、表观遗传学和细胞器的代谢调控

卵母细胞葡萄糖代谢-Sutton McDowall等人系统地综述了卵丘卵母细胞复合体(COCs)对葡萄糖的利用。[35,36]。因此,本文仅对卵母细胞的代谢模式、转运系统和关键酶进行了详细的讨论。

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卵母细胞葡萄糖代谢模式

原始生殖细胞(PGCs)和卵原细胞的能量代谢仍然存在争议。最初显示小鼠PGCS在葡萄糖上优先氧化丙酮酸[ 37 ]。然而,詹森和德波尔的作品〔38〕提示厌氧糖酵解是PGCs防止氧化损伤的主要代谢模式。在整个生长期,小鼠卵母细胞丙酮酸和耗氧量逐渐增加[39]。成熟卵母细胞利用葡萄糖的能力有限[40–C43],葡萄糖首先需要由滤泡细胞转化为丙酮酸,以确保减数分裂成熟成功[18,44–C46]。丙酮酸通过质子连接的一元羧酸载体家族(MCT)[47]转运,小鼠卵母细胞富含MCT[48]的SLC16A成员(图1)。然而,关于哪些MCT(s)以及它们如何介导卵母细胞摄取丙酮酸的重要问题仍然没有答案。强调丙酮酸在卵母细胞成熟过程中的重要性,小鼠卵母细胞特异性缺失PdhÁ1(丙酮酸脱氢酶E1Á)导致严重减数分裂缺陷[12](图1;表1)。有趣的是,狗和猪的卵母细胞似乎以比其他物种更高的速率利用葡萄糖作为初级能量底物[32,49],这意味着卵母细胞中葡萄糖代谢模式的特殊差异。

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卵母细胞葡萄糖转运

尽管丙酮酸是首选的底物,但在卵母细胞中已经检测到葡萄糖代谢和葡萄糖载体介导的摄取机制[41,42,50–C54]。葡萄糖通过钠偶联葡萄糖转运蛋白(SGLTs)或促进性葡萄糖转运蛋白(GLUTs)主动进入细胞。GLUT家族的14个成员已经被确认,包括GLUT1–C12,H偶联的肌醇转运体和GLUT14[29,55]。GLUTs在小鼠[56,57]、奶牛[58]、绵羊[59]、人类[60]和恒河猴卵母细胞[61]中的表达已被报道。小鼠卵母细胞含有GLUT1、glut3和glut8,但尚未检测到GLUT4(主要的胰岛素敏感转运体)[36,62](图1)。目前,对葡萄糖在卵母细胞中的转运机制的研究还很少。

最近,利用一种不可代谢的荧光葡萄糖衍生物,我们揭示了葡萄糖转运到小鼠卵母细胞的细胞间途径,即葡萄糖在卵丘细胞中被摄取,然后通过缝隙连接转移到卵母细胞中[63](图1)。

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卵母细胞葡萄糖代谢相关酶

为了发现卵母细胞中哪些代谢途径起作用,有必要测量相关酶的水平和/或活性。分别在小鼠和人卵母细胞中检测己糖激酶(HK)、果糖激酶(PFK)和丙酮酸激酶(PK)。尽管所有这些都是可检测到的,但人类的水平平均比老鼠的水平高出3-9倍[64],表明它们可能扮演物种特异性的角色。其他与葡萄糖代谢和三羧酸循环(TCA)有关的酶也用生化或细胞化学方法在不同种类的卵母细胞中进行了测定[65–67]。

由野生型细胞和纯合Gpi-fi/fi空细胞(Gpi编码糖酵解酶葡萄糖磷酸异构酶)组成的雌性小鼠嵌合体能够产生来自纯合Gpi-fi/fi空卵母细胞的后代[68],支持小鼠卵母细胞的发育不需要完整的内源性糖酵解的结论。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)是一种胞浆酶,催化戊糖磷酸途径(PPP)的第一步,在卵母细胞内合成卵子发生(图1)。由于G6PDH能将亮丽的甲酚蓝(BCB)染色由蓝色转变为无色,故用BCB染色法测定卵母细胞中G6PDH的活性。G6PDH在小鼠、大鼠和奶牛的排卵前卵母细胞中具有很高的活性,并在卵母细胞成熟过程中经历动态变化[65–C67]。大量的研究表明,G6PDH活性低与受精率和囊胚形成率高有关[69–71],这表明G6PDH活性可能是卵母细胞质量的一个良好指标。然而,BCB染色还没有用于评价人卵母细胞G6PDH活性。

此外,最近发现猪卵母细胞在未成熟期的BCB染色破坏了卵母细胞成熟过程中的线粒体功能,因此不适合在标准的体外成熟方案中应用[72,73]。因此,基于BCB染色的卵母细胞质量评价仍是一个有待解决的问题。

卵母细胞脂质代谢

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卵母细胞中的脂质储存

哺乳动物卵母细胞中的细胞内脂质水平在不同物种间差异很大(4ng/小鼠卵母细胞、63ng/牛卵母细胞和161ng/猪卵母细胞)[74–76]。甘油三酯是卵母细胞中最丰富的脂类,占所有脂类物质的50%以上[77–79],具有巨大的潜在能量储备。脂滴在卵母细胞生长过程中积累,在成熟过程中经历时空变化。例如,在猪和牛卵母细胞体外成熟过程中,尽管在血清中培养,甘油三酯的储存量急剧减少[76,77]。随着小鼠卵母细胞的成熟,脂滴变得更大,位置也更集中[80]。相比之下,在仓鼠和猪卵母细胞中观察到明显的外周分布模式[81–83]。据报道,perlipin-2和脂肪分化相关蛋白(ADRP)围绕着小鼠和牛卵母细胞中的脂滴[80,84],这可能控制脂滴的稳定和脂解利用[85]。此外,使用活体细胞成像方法,Sturmey等人。结果表明,猪和牛卵母细胞中脂滴和线粒体之间存在着密切的空间联系[83,86,87],表明卵母细胞线粒体在脂质代谢中的重要性。

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卵母细胞中脂肪酸的α-氧化反应

脂肪酶将甘油三酯分解成甘油主链和不同链长和饱和度的脂肪酸。脂肪酸的摄取主要是通过细胞表面的脂肪酸蛋白转运体,包括脂肪酸转运酶(FAT)、组织特异性脂肪酸转运蛋白(FATP)和质膜结合脂肪酸结合蛋白(fabpm)(图1)。一旦进入细胞内,脂肪酸通过肉碱棕榈酰转移酶(CPT)穿过线粒体外膜,然后通过肉碱穿过线粒体内膜。在线粒体中,长链酰基辅酶A进入脂肪酸氧化途径,释放乙酰辅酶A。然后,乙酰辅酶A进入TCA循环产生ATP。CPT1被认为是脂肪酸氧化的限速步骤〔88〕(图1)。与其它营养素类(碳水化合物和蛋白质)相比,脂肪酸通过α-氧化途径产生最多的ATP。

Dunning等人对脂肪酸在不同动物模型卵母细胞发育中的作用进行了详细的综述。〔89〕和Mckeegan和Sturmiy〔90〕,因此仅对γ-氧化作了简要说明。棕榈酸、硬脂酸、油酸和亚油酸是猪、牛和人卵母细胞中最丰富的细胞内脂肪酸[78、79、84]。通过使用CTP1抑制剂,已经证明抑制牛和猪卵母细胞成熟过程中脂肪酸的氧化-氧化导致随后胚胎的存活率下降[76, 91 ]。有趣的是,虽然具有低的脂质储备,抑制卵母细胞成熟过程中的α-氧化阻断AMPK介导的减数分裂恢复[92 ]。此外,牛卵母细胞成熟过程中的脂肪酶活性和激素超排后小鼠卵母细胞中的CPT1表达被发现上调[93,94]。最近的研究表明,L-肉碱(CPT1的辅因子)对培养卵泡的补充增强了氧化作用,同时提高了小鼠和牛的卵母细胞核和细胞质成熟度〔95〕C97。类似地,L-肉碱富集体外成熟(IVM)培养基提高谷胱甘肽(抗氧化剂)的浓度,并促进猪卵母细胞发育[98 ]。脂肪酸氧化在细胞核成熟中的重要性也在小鼠、牛和猪中得到证实(99)。这些结果共同表明,脂肪酸的代谢,特别是α-氧化途径,是维持哺乳动物卵母细胞发育能力所必需的。

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细胞信号转导中的脂肪酸

除了为细胞提供能量外,脂肪酸及其前体/代谢物也被报道为非代谢过程,特别是细胞信号转导过程所必需的[100,101]。甘油二酯(DAG)是甘油脂质代谢的中间产物,是历史上已知的第一个脂质第二信使[102–C104]。DAG是由磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸脂水解产生的,蛋白激酶C(PKC)是其主要作用因子。DAG与PKC中保守的C1结构域结合可导致PKC活化、调节细胞周期、细胞存活、恶性转化和凋亡[105]。值得注意的是,PKC同工酶参与了卵母细胞发育过程中的多个关键步骤,如减数分裂恢复、纺锤体组织和激活[106–C108](图1)。神经酰胺,鞘磷脂水解的直接脂质产物,被证明是爪蟾卵母细胞减数分裂周期进展的生物效应物[109,110]。脂肪酸还结合核受体和转录因子,如过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)和固醇调节元件结合蛋白(SREBP)〔111〕。在小鼠和牛卵母细胞中已经检测到PPAR和亚克隆,可能与胚胎发育和雌性生育力有关(112, 113)。虽然脂质作为次级信使在哺乳动物卵母细胞发育控制中的作用很有希望,但目前几乎是一个未被探索的研究领域

卵母细胞氨基酸代谢

氨基酸通过一系列特殊的系统进入细胞,在细胞功能中起着重要的作用,包括蛋白质合成、能量产生、有机渗透压细胞和细胞内缓冲液[114–C116]。在过去的几十年中,人们对植入前胚胎中的氨基酸进行了广泛的研究。而哺乳动物卵母细胞生长发育过程中氨基酸的转运和利用却鲜为人知。

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卵母细胞中氨基酸的转运系统

氨基酸转运系统的经典定义是由其底物特异性的范围和是否存在专一性钠共转运[117,118]。Colonna等人。首先检查了氨基酸转运在整个卵子发生过程中分离的小鼠卵母细胞系统。虽然成熟的GV卵母细胞缺乏A-转运系统,但它们证明了L-和asc系统的利用[119]。Van Winkle等人。后来发现,在未成熟卵母细胞中,甘氨酸主要通过系统甘氨酸转运,半胱氨酸/谷氨酸主要通过系统转运[120121]。同样,在成熟卵母细胞中也相继检测到了系统∗、L、GLY和b0。最近,Pelland等人。【117】测定了小鼠卵母细胞中9种氨基酸的转运特性,并测定了11种经典氨基酸转运系统的活性。甘氨酸,在卵母细胞生长过程中活性较低,在减数分裂成熟过程中强烈上调。五十、 b0和asc/asc在整个卵母细胞生长和成熟过程中都具有持续的活性。与此一致的是,卵母细胞呈现出不同的氨基酸转运模式[117]。

据报道,小鼠卵母细胞包埋或卵母细胞剥落的卵母细胞在含有[14C]L-丙氨酸的培养基中培养时,卵母细胞包埋组的卵母细胞放射性水平较高[125]。与小鼠卵母细胞相比,Slc38a3(编码对丙氨酸有高度底物偏好的钠偶联中性氨基酸转运体的转录本)在卵母细胞中大量表达[126]。迄今为止,在颗粒细胞存在的情况下,甘氨酸、丙氨酸、牛磺酸和赖氨酸进入卵母细胞的运输速率已经得到了证实[117、120、125]。这些发现强烈暗示卵母细胞和滤泡细胞之间的代谢合作涉及氨基酸的摄取。令人惊讶的是,卵泡细胞并没有赋予封闭卵母细胞额外的氨基酸转运能力,在某些情况下,它们似乎抑制了小鼠卵母细胞对亮氨酸的摄取[117]。

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卵母细胞中氨基酸的利用

卵母细胞中存在大量的转运系统,表明它们有能力利用外界环境中的氨基酸。谷氨酰胺被认为是支持卵母细胞发育的有效能量底物。例如,使用谷氨酰胺作为唯一的能量来源足以启动COC内小鼠卵母细胞的减数分裂恢复,尽管不能通过MII阶段进行[127]。在培养基中添加谷氨酰胺可促进牛、仓鼠、狗、兔和恒河猴卵母细胞的成熟[115128–C131]。谷氨酰胺、天冬氨酸和缬氨酸也能防止猪卵母细胞的多精子受精[132]。

动物细胞通过主动调节渗透活性溶质的细胞质浓度来控制其体积,从而改变细胞内渗透压[133]。Tartia等人。[134]对小鼠卵母细胞的体积调节进行了细致的研究。他们发现,GLYT1,一种甘氨酸转运蛋白,在未成熟的GV卵母细胞中是静止的,卵母细胞中也含有很少的内源性甘氨酸。然而,在排卵开始的几个小时内,GLYT1介导的甘氨酸转运在卵母细胞中被激活。同时,卵母细胞能够利用甘氨酸调节其体积。这些观察结果表明,甘氨酸依赖的细胞体积调节机制存在于卵母细胞(图1)。

卵母细胞代谢、母体营养和生殖结局:连接点

越来越多的证据表明,过多的体脂会对女性生育和怀孕产生不利影响。肥胖妇女即使经常骑自行车也要花更长的时间才能怀孕,而且有很高的流产、子痫前期、妊娠糖尿病和后代先天缺陷的风险[135–137]。同样,糖尿病控制不良的妇女往往会遭受一系列的生殖问题,如流产、新生儿发病率和死亡率以及先天畸形[138–140]。此外,尽管在整个怀孕期间血糖得到控制,这些妇女的妊娠并发症的发生率仍然高出3到5倍[141],这表明母亲糖尿病可能对女性生殖产生永久和不可逆转的影响。同时,动物研究也表明,一系列宏微量营养素的缺乏或过量与生殖性能、生育能力、胎儿发育和长期后代健康的严重损害有关[142–144]。

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母亲营养与生殖

在过去的30年里,大多数研究都集中在早期胚胎和后代的发育上,研究母体营养对人类和动物模型生殖的影响。

在啮齿动物模型中,母亲的高血糖和肥胖已经被证明会对从单细胞合子到囊胚的发育产生不利影响[148–153]。最近,我们发现从糖尿病小鼠到非糖尿病小鼠的单细胞合子移植仍然会显著增加后代的先天畸形和生长迟缓[154]。在喂食高脂饮食(HFD)的小鼠中也观察到类似的表型[153]。这些发现表明,在卵子发生和受精过程中暴露于紊乱的代谢条件下,足以对胎儿进行永久性的规划,使其发生形态变化。

来自人类诊所的数据显示,肥胖妇女的着床率和怀孕率比正常体重妇女低[155156]。卵母细胞捐赠模型已被用来确定卵母细胞/胚胎质量或子宫容受性是导致妊娠率下降的主要原因。有几个系统性的评论说明了这个问题,并产生了相互矛盾的结果[159–165]。尽管如此,大多数回顾性研究表明,体重指数(BMI)不太可能对子宫内膜容受性产生负面影响,质量差的卵母细胞或由此产生的胚胎更有可能是超重妇女出现生殖问题的原因[161162]。最近,一项对45000个辅助生殖技术(ART)周期的大规模分析得出结论,肥胖的增加与怀孕可能性的降低相关。只有在使用自体卵母细胞时才观察到这种效果。如果使用来自瘦女人的供体卵母细胞,效果会减轻[166],支持卵母细胞来源决定生殖结果的观点。

总之,有人提出母体代谢紊乱早在卵母细胞期就有不利影响,这进一步使它们易患胚胎发育异常甚至后代代谢疾病。母体营养、卵母细胞质量和生殖结局之间的直接因果关系尚未明确确定。然而,这种关系的证据继续巩固。在此,我们将从实验动物模型和不孕症临床两个方面总结与母体营养对卵母细胞发育影响相关的数据,并从卵母细胞代谢的角度进行分析。

营养对卵母细胞代谢的影响-卵母细胞在离开原始休眠池和卵泡生长期时,对卵泡环境的变化特别敏感,尤其是营养物质变化引起的应激[167]。卵泡环境是动物生理状态的反映。因此,母体营养的变化可能会对卵母细胞的代谢活性产生显著影响。如上所述,卵母细胞代谢不当必然会影响卵母细胞的质量和胚胎的发育。

糖尿病是一种以血糖升高为特征的代谢性疾病。利用I型糖尿病小鼠模型,我们发现母体糖尿病显著导致卵母细胞线粒体的结构和空间改变[168]。与此一致,糖尿病小鼠排卵前和排卵期卵母细胞中的ATP和TCA循环代谢物(包括柠檬酸、苹果酸和天冬氨酸)水平降低[155、156、168、169]。类似的现象也出现在HFD小鼠和高胰岛素血症小鼠身上[153170]。ATP含量的变化可能会影响卵母细胞的质量、胚胎发育和着床过程[171172]。具体来说,微管的组装和减数分裂期间的染色体移动需要ATP[173]。小鼠卵母细胞线粒体损伤可降低ATP含量,破坏减数分裂纺锤体[174]。PdhÁ1缺乏的小鼠卵母细胞显示出ATP水平不足以及染色质和微管异常[12]。来自衰老加速小鼠的卵母细胞显示纺锤体缺陷和与线粒体功能障碍相关的染色体排列紊乱[175]。最近,在pombe裂殖酵母中发现线粒体与纺锤体极的关联有助于纺锤体的排列[176]。此外,低mtDNA和ATP含量也可能导致在人卵母细胞中没有用PolScope成像的双折射纺锤体[177]。因此,推测线粒体代谢紊乱可能与糖尿病、肥胖和胰岛素抵抗小鼠卵母细胞中观察到的纺锤体缺陷和染色体错位有关。

活性氧(ROS)的形成是线粒体氧化磷酸化的副产品[ 178, 179 ]。Igosheva等人。[180]报道肥胖小鼠卵母细胞NAD(P)H含量增加,FAD自身荧光降低,表明ROS生成增加。韦克菲尔德等人。[181]发现,饲喂富含长链n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)的饲料会导致小鼠卵母细胞线粒体功能障碍和ROS水平升高,从而降低受精能力和胚泡形成。这些数据表明,过量的产妇营养可能不利地影响卵母细胞的线粒体状态,特别是能量产生和氧化应激,并最终破坏卵母细胞代谢。

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多囊卵巢综合征(PCOS)与代谢紊乱有关

多囊卵巢综合征和高雄激素血症妇女的典型特征是在体外受精(IVF)过程中获得的卵母细胞数量增加。然而,这些卵母细胞通常是质量差,导致受精/着床率较低和流产率较高[182]。通过喂饲添加脱氢表雄酮(DHEA)的小鼠chow,我们用高雄激素模型显示DHEA暴露小鼠卵母细胞中柠檬酸盐水平、G6PDH活性和脂质含量显著低于对照组[183],表明TCA和PPP代谢异常。与动物模型的结果不一致,多囊卵巢综合征患者的卵母细胞显示葡萄糖/丙酮酸消耗增加,与对照组相比细胞内NAD(P)H含量降低[184]。这种差异可以解释为:(1)尽管各种动物模型已经被证明能模拟肥胖或多囊卵巢综合征妇女的关键表型,但没有一种模型能完全复制复杂的临床疾病[185–187];或者(2)由于控制数量有限,人类卵母细胞的数据有时是可变的年轻健康女性卵母细胞。

HFD小鼠排卵前COCs卵母细胞内的脂质水平较高[188–190]。同样,体内高血糖环境和体外高糖培养都会提高小鼠卵母细胞的游离葡萄糖水平[63]。糖尿病小鼠未成熟卵母细胞的糖原含量也较高,而随着减数分裂的恢复,果糖-1,6-磷酸(FBP)水平升高[169],这表明高血糖环境导致在卵母细胞成熟前作为糖原储存的葡萄糖积累。相比之下,糖尿病卵母细胞中脂肪酸代谢(羟酰辅酶a脱氢酶;Hadh2)和氨基酸代谢(谷氨酸丙酮酸转氨酶;Gpt2)的两种主要代表酶活性低于对照组。此外,糖尿病大鼠模型显示,从卵巢分离的排卵和未成熟COCs中前列腺素(PGE2)的产生都发生了改变[191、192]。其中一些条件被认为是导致糖尿病动物卵母细胞减数分裂行为紊乱的原因。

反刍家畜也是揭示围产期营养状况及其对繁殖性能影响的重要模型。在乳牛中,高淀粉饮食对卵母细胞发育能力有负面影响,当增加亮氨酸摄入量时,这些都是可以避免的[193]。粗蛋白过度进食也损害了随后的牛卵母细胞发育成囊胚的能力,可能是通过滤泡环境中氨和尿素浓度升高的直接毒性效应〔194, 195〕。然而,营养对反刍动物卵母细胞代谢的影响仍缺乏评价。代谢紊乱与这些动物的卵泡/胚胎代谢之间的关系已经被广泛的综述[142、196、197]。

潜在机制:卵母细胞代谢与母体营养和生殖结局的关系

代谢条件对卵母细胞代谢和发育的影响见表2。图2显示了母体营养对卵母细胞代谢和生殖结果影响的拟议途径示意图。

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代谢对卵母细胞线粒体和减数分裂的影响

线粒体是由外膜、内膜、膜间隙和基质组成的双层膜细胞器。大量的酶参与不同的代谢途径存在于线粒体基质中,作为细胞能量产生的主要场所。线粒体也有自己的母系遗传基因组,线粒体DNA(mtDNA)。线粒体是卵母细胞中最丰富和最突出的细胞器,在卵母细胞成熟过程中,线粒体的超微结构和分布会因能量需求的不同而发生阶段性变化[198]。氧化磷酸化(OXPHOS)的ATP合成是线粒体的主要功能。大多数ROS是在线粒体呼吸链电子泄漏时产生的。尽管线粒体是活性氧产生的主要场所,但过量的活性氧会损害卵母细胞的线粒体功能[199]。卵母细胞中的线粒体功能已经被广泛的研究[10、167、179、200]

卵泡液来源于鞘内毛细血管的血液。随着卵泡发育的进行,液体积聚在卵泡腔中,沐浴卵母细胞并提供卵母细胞发育所需的环境[201]。来自动物模型和人类诊所的数据表明,代谢紊乱反映在排卵前卵泡的微环境中[182、202、203]。

通过酶法测定单个卵母细胞内游离葡萄糖,发现糖尿病小鼠卵母细胞内葡萄糖含量高于对照小鼠[63]。高血糖导致的线粒体功能障碍在各种细胞类型中都有报道[204205]。与此一致,在糖尿病小鼠卵母细胞中观察到线粒体特性的改变,特别是线粒体肿胀和ROS生成增加[168](图1)。与卵泡游离脂肪酸水平升高相关,在HFD小鼠卵母细胞中检测到明显的脂质积聚[188]。当暴露于高脂环境中时,细胞积累甘油三酯液滴和游离脂肪酸,对其他细胞器如线粒体和内质网(ER)造成显著损害;此过程称为脂毒性[206]。肥胖和胰岛素抵抗小鼠卵母细胞线粒体功能障碍和内质网应激已被不同的组报道[153,170,180,188,189,200]。总的来说,卵母细胞对营养信号的能量代谢紊乱可能导致减数分裂成熟和受精的可能性降低,以及植入前胚胎发育受损。此外,这些异常的卵母细胞线粒体可能在胚胎发生和胎儿发育过程中被母系传输到胚胎,从而导致代谢紊乱的女性出现生殖问题(图2)。

再生科学助孕:卵母细胞发育的代谢控制与母体营养,影响备孕结果

图2。母体营养状况对卵母细胞代谢及生殖结局影响的途径示意图

除了卵泡环境对卵母细胞代谢的直接作用外,对颗粒细胞的有害影响还可能破坏与卵母细胞的营养和信号相互作用,间接导致卵母细胞功能不全,从而导致妊娠结局不佳。卵母细胞缺乏利用葡萄糖作为能量底物的能力,需要卵丘细胞提供糖酵解副产物来进行自身发育。丙酮酸和ATP作为卵母细胞糖酵解的相关产物,可以转移到卵母细胞中[207]。

值得注意的是,在肥胖和糖尿病小鼠的颗粒细胞中,异常代谢增加了细胞凋亡,线粒体功能减弱[156188208–C210]。尤其是,糖尿病小鼠卵丘细胞的葡萄糖摄取显著减少,并显示出与封闭卵母细胞中ATP水平降低密切相关[211]。减数分裂恢复后,卵母细胞在转录上变得不活跃。在在此阶段,ATP只需要维持卵母细胞的基础代谢和纺锤体形成[212]。与这一概念一致,小鼠模型揭示了母体糖尿病、肥胖和高胰岛素血症在卵母细胞中诱导了不同的、畸形的纺锤体和染色体错位[153168170213]。同样,Machtinger等人。直接评估了女性严重肥胖(II级和III级肥胖)与卵母细胞特征之间的可能联系。在严重肥胖的患者中,他们已经显示出在未能受精的卵母细胞中细胞骨架异常的高患病率[214]。纺锤体装配和染色体移动中的任何错误都可能导致卵母细胞染色体不平衡,这是导致流产和先天性出生缺陷的主要遗传原因[14,215,216]。

因此,颗粒细胞能量底物的限制有可能破坏卵母细胞的代谢平衡,产生非整倍体生殖细胞,并导致代谢紊乱引起的生殖问题。

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表观遗传学的代谢调控

如上所述,母体代谢紊乱会对卵母细胞质量产生不利影响,导致胎儿生长迟缓和发育缺陷,即使将其从应激环境中移除并转移到正常的子宫环境中。由于这些胎儿畸形发生在环境损伤后很长一段时间,对卵母细胞的营养影响可能通过表观遗传途径传播。印记是一种表观遗传机制,其中基因表达的父母的起源特定的方式。印记表观遗传的染色体基础是CpG序列的甲基化。印记的建立发生在亲代的生殖系中,亲代印记的维持始于胚胎发育时期[217]。本文研究了糖尿病小鼠卵母细胞发育过程中几个印记基因的甲基化状态。结果表明,母体糖尿病改变了Peg3差异甲基化区(DMR)的甲基化模式,且H19和Snrpn-DMRs无明显变化[218]

此外,在糖尿病小鼠卵母细胞成熟过程中也观察到组蛋白H3和H4乙酰化模式的差异[219]。与之形成鲜明对比的是,无论是肥胖母鼠还是其后代,卵母细胞印记基因的DNA甲基化都没有改变。然而,代谢相关基因的DNA甲基化发生了改变。在肥胖小鼠卵母细胞中,瘦素启动子的DNA甲基化水平显著升高,PPAR启动子的DNA甲基化水平降低(220)。有趣的是,罗格列酮能够使肥胖小鼠的卵母细胞发育能力正常化(221),这表明它的靶点——PPARγ可能是控制卵母细胞质量的代谢机制的关键调节因子。未能建立或维持生殖细胞甲基化模式可能导致胎儿生长异常、胎盘衰竭和人类疾病[222]。

一个研究较少但新近出现的概念是将有关细胞代谢状态的信息整合到表观遗传学的调控中[223]。各种酶负责增加或消除表观遗传修饰已被确定。这些在表观遗传基因调控中发挥重要作用的酶利用细胞代谢产生的底物或辅因子,从而在营养、代谢和表观遗传修饰之间提供潜在的联系[224]。大多数细胞溶质乙酰辅酶A来自哺乳动物细胞线粒体输出的柠檬酸盐。用放射性标记的葡萄糖追踪实验表明,组蛋白H4K16上约一半的乙酰基来自葡萄糖乙酰辅酶A[225](图1)。类似地,乙酰辅酶A生成酶的废除导致整体组蛋白乙酰化降低[226]。S-腺苷蛋氨酸(SAM)以ATP依赖的方式从必需氨基酸蛋氨酸中提取。组蛋白和DNA甲基化都需要SAM作为高能甲基供体[227]。对于低的ATP/AMP比率,AMPK可以转移到染色质和磷酸化组蛋白H2B丝氨酸36[228](图1)。还有证据表明,葡萄糖和葡萄糖代谢的变化会留下持久的表观遗传标记[229]。

特别值得注意的是,在缺乏营养的情况下,卵母细胞中的代谢紊乱,如柠檬酸盐水平降低、ATP/AMP比值和糖/脂积累被发现。本文概述的研究结果为理解营养对卵母细胞代谢的影响如何影响表观遗传修饰,从而影响表观遗传改变所起作用的胚胎/后代发育提供了一个机制框架(图2)。今后的研究重点应放在确定特定代谢产物和代谢共基质如何与染色质相互作用,从而表观改变基因表达。

此外,越来越多的证据表明代谢性mTOR/PTEN/PI3K信号通路在小鼠卵泡生长和卵母细胞发育过程中起着关键作用[230,231]。遗传数据显示,卵母细胞中缺乏PTEN的小鼠在成年早期,所有原始卵泡都会耗尽,导致卵巢早衰[232]。PI3K-AKT-mTOR途径参与卵母细胞mRNA翻译的体细胞调控,影响其发育能力[233]。值得注意的是,HFD诱导的肥胖通过激活mTOR信号促进大鼠卵巢卵泡发育和卵泡丢失率[234]。mTOR最近也被证明在PCOS小鼠卵巢中发挥作用[235]。然而,卵母细胞中的这些代谢途径是否介导了营养对妊娠结局的影响尚不清楚。本课题将是一个有价值的研究方向,值得进一步关注。此外,为了应对母体营养的变化,已经确定了一系列卵巢外和卵巢内因子的波动,如表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGFs)和瘦素[182、236、237]。它们是否以及如果是如何影响卵母细胞质量和生殖结果,需要进一步澄清,此处不作讨论,因为这超出了本综述的范围。

总之,越来越多的证据支持一个模型,即母体营养失衡会扰乱卵母细胞的能量代谢。这种破坏通过减数分裂、线粒体或表观遗传修饰的代谢控制进一步导致生殖问题。结果,减数分裂缺陷导致非分离诱导胚胎非整倍体。线粒体功能失调的补体在胚胎发育过程中是母系传递的,表观遗传变化可能在胚胎发育过程中传播,导致后代发育异常。需要进一步澄清,以排除卵母细胞中其他可能的代谢相关途径,这些途径介导母体营养对生殖结果的影响。

代谢分析与卵母细胞质量

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卵母细胞中代谢物的测定

哺乳动物卵母细胞的代谢分析始于20世纪80年代,它主要使用放射性标记的底物来定义代谢产物卵母细胞的生长和成熟需要。这一领域的一系列基本发现相继被发现,如葡萄糖和丙酮酸的利用、核糖核苷和次黄嘌呤的摄取和代谢以及卵母细胞发育过程中氨基酸的转运[40,52,117,238–242]。或者,我们开发了一种技术来测量单个卵母细胞或植入前胚胎中的代谢物和酶活性,该技术使用的不是放射性而是基于吡啶核苷酸荧光信号放大的酶循环反应[243]。NADH和NADPH在紫外光附近有相同的吸收带,在340nm处达到峰值。NAD和NADP在此波长不吸收。因此,在分光光度计中可以测量氧化或还原的变化。

根据这一原理,对每种代谢物分别进行分析,并设计成将以NAD/NADH或NADP/NADPH结尾的反应连接起来,然后在循环反应中被酶放大,在荧光分析中测量放大步骤的副产物。我们之前的文献[64169244]已经描述了详细的分析条件。

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卵母细胞质量标志物的代谢组学研究

最近的研究试图超越单一的物质来研究卵泡环境中的全部生化成分,这被称为代谢组学。代谢组学分析旨在确定和量化整个细胞内和细胞外代谢物的收集。从概念上讲,代谢组学中有两种基本的分析方法:目标分析(仅限于单一或选择性定义的代谢物分析)和代谢物谱分析(使用单一分析技术研究目标化合物及其代谢中间产物的选择性基团)[245]。代谢组学的应用受到广泛的关注。然而,由于需要大量的物质,直接对卵母细胞进行代谢组学分析仍然是一个巨大的挑战。因此,开发一种将纳米和股骨样本的代谢谱分析技术,甚至降低到单细胞水平[246–C248],将大大提高我们对卵母细胞代谢的认识,改善体外成熟系统。

卵母细胞质量作为生殖技术的关键因素,对受精、早期胚胎存活、妊娠维持乃至后代健康都有着深远的影响。因此,目前生殖生物学家面临的一个重要难题是寻找可靠的无创预测人和动物生殖卵母细胞质量的指标。总的来说,由于其主观性和不精确性,用形态学特征作为卵母细胞质量的预测指标仍然存在争议。卵泡为COC的发育提供了非常重要的微环境。这使得卵泡细胞和卵泡液中分泌的因子成为无创和可操作的卵母细胞质量预测因子的理想来源。涉及卵泡液、卵丘细胞或培养基的基因组、转录组、蛋白质组或代谢组分析的全球评估策略已应用于辅助生殖[249]。代谢组学允许对生物过程的理解得以完成,因为它能够提供由于疾病、药物暴露或营养改变而发生的细胞过程的生物终点标记[250]。

目前,对代谢物剖面的评估是基于光谱/光谱和色谱技术,如核磁共振(NMR)光谱、质谱光谱分析法(MS;通常与色谱法结合)和光学光谱法。核磁共振和质谱都能用一个样品产生多种化合物的信息,并已应用于培养基和卵泡液的分析[251–C255]。核磁共振首次用于记录卵泡发育过程中卵泡液中脂蛋白浓度的变化[256]。大鼠颗粒细胞的核磁共振分析表明,卵泡刺激素(FSH)增加了磷酸戊糖途径的活性[257]。使用基于气相色谱-质谱(GC/MS)的代谢组学,Bender等人。[258]发现奶牛卵泡液中饱和脂肪酸含量较高,而小母牛卵泡液中二十二碳六烯酸含量较高。奶牛体内有害饱和脂肪酸含量的升高将对卵母细胞成熟和早期胚胎发育产生负面影响,这可能解释了小母牛和泌乳母牛生育能力的差异。

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卵泡液的液相色谱

串联质谱(LC-MS/MS)分析显示,与肥胖无关的多囊卵巢综合征患者的芳香族氨基酸含量增加,而支链氨基酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸和精氨酸的含量随着体重指数的增加而升高[259]。卵泡液中特定氨基酸的破坏可能损害卵母细胞的质量,导致肥胖和多囊卵巢综合征妇女的妊娠结局较差。高效液相色谱分析也表明,非侵入性氨基酸图谱可用于牛卵母细胞发育能力的测定[260]。代谢分析中最常用的光谱学类型是近红外光谱(NIR)和拉曼光谱。尽管通过这两种方法获得的代谢物分析与胚胎的发育潜能成功相关[254,261,262],但也有相反的结果被报道[263264]。

总的来说,缺乏对卵母细胞和周围卵丘细胞的直接代谢组学分析。来自这一领域的数据无疑将为卵母细胞发育的代谢调控提供一个必要的网络。

结论

本文综述了卵母细胞发育所必需的代谢途径。这一领域的研究重点主要集中在外源营养素上,因此运输系统和代谢酶对卵母细胞生长发育的内在调控相对被忽视。代谢紊乱,如肥胖和糖尿病,对生育、怀孕和后代的健康都有重大的不利影响。在本综述中,我们强调了内源性卵母细胞代谢与母体营养和生殖结局之间的联系,重点是减数分裂、线粒体和表观遗传修饰的代谢控制。

显然,需要进一步的研究来揭示在胚胎发生和后代发育过程中营养对卵母细胞代谢的影响是如何传播的机制细节。通过卵泡液、卵丘细胞和培养基的代谢组学分析,全球评估策略已应用于辅助生殖。代谢组学数据可以作为预测卵母细胞质量从而预防生殖缺陷的指标,但其应用仍处于婴儿期。

原文:Cell Mol Life Sci. 2015 January ; 72(2): 251–271. doi:10.1007/s00018-014-1739-4.

总而言之,卵母细胞发育的代谢控制与母体营养息息相关,会影响生育结局及其胎儿发育。

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